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超高效液相色谱-串联质谱测定水中10种藻毒素
更新时间:2021-01-13 来源:深圳市水务(集团)水质监测站 作者:朱颖

朱颖

(深圳市水务(集团)水质监测站,广东深圳,518000)

 

   采用超高效液相色谱-串联质谱法快速测定水中10种藻毒素的含量。水样经过聚四氟乙烯亲水滤膜过滤后,采用BEH C18柱( 1.7um 2.1x100 column)分离,以超高效液相色谱-电喷雾离子源正离子多反映模式进行检测,外标法定量。10种目标物在0~50 ug·L-1浓度范围内线性相关系数在0.99以上,方法检出限为0.08~0.45 ug·L-1,在1、10、20 ug·L-1 3个水平添加浓度时,其平均回收率在71.32%~114.59%,相对标准偏差为0.77%~9.76%。该方法前处理简单、选择性强、灵敏度高,适用地表水和饮用水中藻毒素的日常检测。

关键词  超高效液相色谱-串联质谱法;微囊藻毒素;节球藻毒素;拟柱胞藻毒素;地表水;饮用水

 

Determination of 10 Algal Toxins in Water By UHPLC-MS/MS

ZHU Ying

 

(Shenzhen Water (group) water quality monitoring station, Shenzhen   518000, China)

 

Abstract   UHPLC-MS/MS was applied to the determination of 10 algal toxins in water. After filtration with hydrophilic polytrafluoroethylene filter membrane, the water sample were separated by BEH C18 chromatographic column(2.1 mmx100 mm, 1.7um), detected by UPLC-electrospray positive ionization(ESI+) with multiple reaction monitoring (MRM), and quantified by external standard method. The linear relationships of 10 algal toxins were good in the range of 0-50ug·L-1, the correlation coefficient was greater than 0.99, and the detection limit of the method was 0.08-0.45 ug·L-1. The average recoveries at 3 spiked levels(1, 10, 20 ug·L-1) were 73.12%-114.59%, with the relative standard deviation of 0.77%-9.76%. This method is efficient, selective and sensitive, and is suitable for routine detection of algal toxins in source water and drinking water.

 

Keywords   UPLC-MS/MS    microcystin    nodularin     cylindrospermopsin    surface water    drinking water 

  

近年来,地表水中蓝藻水华引发了各种水质问题,其中以藻毒素产生的水质安全备受关注。目前常见的藻毒素中,以微囊藻毒素(MCs)、拟柱孢藻毒素和节球藻毒素最为常见。微囊藻毒素(microcystins,MCs)是蓝藻类有毒代谢物,该类毒素毒性很强,具有较强的致癌作用,能够对人与动物的肝脏、心脏等器官以及免疫系统产生毒害作用[1]。拟柱孢藻毒素是蛋白质合成的抑制剂,它通过抑制蛋白质的合成而导致肠胃炎、肝损伤、肾损伤、肠损伤,可危及人体的健康[2]。节球藻毒素主要由泡沫节球藻产生,其结构与微囊藻毒素类似,是一种环状五肽结构,抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A的活性[3]我国地表水环境质量标准GB3838-2002中微囊藻毒素-LR的限值为1 ug·L-1,一些国家对拟柱孢藻毒素的(巴西15ug·L-1,新西兰1 ug·L-1)和节球藻毒素(1 ug·L-1)也做出了规定[4]

以蓝藻问题为导向的大部分研究集中于水源水中微囊藻毒素的检测。很少涉及到节球藻毒素和拟柱孢藻毒素以及水务公司供水系统中的出厂水、管网水。现行国标GB/T 20466-2006《水中微囊藻毒素的测定》[5]。,GB/T 5750.8-2009《生活饮用水标准检验方法有机物指标》[6],测定时需对水样进行多次的富集,需用上1L和5L水样进行富集,才能满足检测要求。本文对水务公司水质监测对象水源水、出厂水、管网水中的八种微囊藻毒素、拟柱孢藻毒素和节球藻毒素共10种藻毒素进行检测方法开发。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱进行二级质谱分析,方法无需前处理、灵敏度高、检出限达到相应法规的要求。

 

1 实验部分

 

1.1 仪器与试剂

 

超高效液相色谱-串联质谱联用系统; Acquity H-class 超高效液相色谱(美国Waters公司);Xevo TQ-S micro三重四级杆串联质谱 (美国,waters公司);色谱柱ACQUITY UPLC ®BEH C18( 1.7um 2.1x100 column)(美国,waters公司);氮气发生器(PEAK®  GeniusXE35);去离子水发生器(Thermo scientific ® MicroPure UV);聚四氟乙烯亲水滤膜(PTFE-Q,0.2um,13mm,美国Agilent公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯,美国Aladdin公司);甲酸(美国Sigma-Aldrich公司);节球藻毒素(NOD)、拟柱孢藻毒素(CYN)、微囊藻毒素-LR(MC-LR)、微囊藻毒素-RR(MC-RR)、微囊藻毒素-YR(MC-YR)、微囊藻毒素-WR(MC-WR);微囊藻毒素-LA(MC-LA);微囊藻毒素-LF(MC-LF);微囊藻毒素-LW(MC-LW)、微囊藻毒素-LY(MC-LY)均购自Be Pure®公司,浓度为10ug/ml,甲醇溶质。

 

1.2 仪器工作条件

 

1.2.1 色谱条件

 

Waters ACQUITY UPLC ®BEH C18( 1.7um 2.1x100 column),柱温30.0℃;流量0.4 ml·min-1;进样量10uL。 流动相:A为0.1%(体积分数)甲酸溶液,B为乙腈。梯度洗脱程序0~0.2min时,B为5%;0.2-2.5min时,B由5%升至60%,保持3.5min;6-6.5min时,B由60%升至95%,保持1min,7.5-7.6min时,B由95%降至5%,保持4.4min。

 

1.2.2 质谱条件

 

电喷雾正离子源(ESI+);多反映监测(MRM)模式;毛细管电压2.5V;脱溶气温度550℃;脱溶气流速950L/Hr;锥孔气流速50L/Hr;离子源温度120℃。其余质谱参数见表1,其中*为定量离子。

表1.png

1.3 试验方法

 

50ml棕色玻璃瓶采集满瓶水样(不留顶空),采集后的水样在4℃暗处储存,当天分析。用聚四氟乙烯亲水滤膜(PTFE-Q)过滤样品,按照仪器工作条件进行测定。

 

2 结果和讨论

 

2.1 质谱条件的优化

 

    根据藻毒素的理化性质和化学结构,选择ESI源做离子源,正模式分析。微囊藻毒素(MCs)为具有7个氨基酸片段的环状多肽化合物[7],在三重四级杆上进行一级质谱和二级质谱扫描,发现本文研究的微囊藻毒素、节球藻毒素均可以产生[M + H] +[M + 2H] +的母离子,选取丰度较高的特征碎片离子(m/z约为135)和m/z约为127)作为定量离子,其他离子作为定性离子。拟柱孢藻毒素选择(m/z约为194)作为定量离子,其他碎片离子作为定性离子。10种藻毒素的各个离子见图1。

质谱的毛细管电压、离子源温度与检测灵敏度有一定关系,本研究分别选取了2、2.5、3KV以及离子源温度120℃、150℃分别进行试验研究,对比发现10种藻毒素在毛细管电压2.5KV、离子源温度120℃时整体响应最好,因此选用毛细管电压2.5KV、离子源温度120℃。

表2.png

 

2.2 液相条件的优化

 

试验采用藻毒素常用的乙腈-水反向体系作为流动相。有文献报道在流动相中加入0.1%甲酸可以提高目标物的离子化效率,有助于藻毒素母离子的形成,增加响应值[8]。试验三种甲酸含量流动相(0.05%,1%,2%),发现1%甲酸含量响应高于0.05%,甲酸含量提升至2%响应较1%变化不大,最终选择乙腈-0.1%甲酸水作为流动相。

试验开始采用5%~95%乙腈线性梯度,除拟柱孢藻毒素在3min钟前出峰,其余藻毒素均在4-10min钟出峰见图2(a)。根据出峰时间判断,剩余9种藻毒素从60%乙腈处开始出峰,故调整至现有梯度。试验发现10种藻毒素均在5min内出峰图2(b),且整体响应要大于第一种梯度响应。为提高整个系统的稳定性,增加了高有机相冲洗、低有机相平衡时间,总时长为12min。

表3.png

2.3 样品前处理的优化

 

实际水样中藻毒素含量通常很低,需要固相萃取富集才能达到仪器的检出限。本方法采用的超高效液相色谱-串联质谱法仪器灵敏度高,可以达到现行国标的限值。因此,方法采用直接进样分析。

样品测定时,为了防止样品溶液中微小颗粒物对测定系统的影响,需要滤膜过滤水样。吴洁珊[9]等实验比较了9种不同材料、不同规格的滤膜对藻毒素的吸附作用,发现亲水聚四氟乙烯滤膜在考虑了成本及对藻毒素的吸附性因素下为最优选择。本实验采用亲水聚四氟乙烯滤膜过滤水样,实际水样的加标回收率显示均大于70%,可以满足日常检测的需求。

 

2.4 方法学指标

 

2.4.1 线性和检出限

 

配置了浓度为0.1 ug·L-10.2ug·L-10.5 ug·L-11 ug·L-12 ug·L-15 ug·L-110 ug·L-120 ug·L-150 ug·L-1梯度的10种藻毒素混标,从低到高进行分析测试。采用外标法定量,以目标物的定量离子峰面积对溶液质量浓度绘制标准曲线,得到线性回归方程,各藻毒素的线性回归方程见表2,各化合物在所分析的含量范围(0~50 ug·L-1)内线性关系良好,相关系数均大于0.99.

 表4.png

 

2.4.2方法的回收率与精密度

 

在地表水、出厂水、管网水中添加不同浓度水平的标准溶液,按上述方法进行测定,每个浓度平行测定7次,计算回收率及相对标准偏差(RSD),结果见表3。结果表明,地表水、出厂水、管网水的加标测定值的相对标准偏差为0.77%~9.76%,回收率为71.32%~114.59%,满足日常测定要求。

表5.png


2.5 实际样品检测

 

采集5月份本地水源水、出厂水、管网水各三个点,进行实际样品分析,结果见表4。

表6.png

3 结论

 

1)10种藻毒素标准曲线线性好,分析准确度高,精密度好,检出限能够满足WHO及我国地表水、饮用水相关控制标准要求

2)实际样品无需前处理,滤膜过滤直接进样品,分析时间仅需12min,该法快捷简便,环境友好,适合藻毒素污染的应急突发事件快速检测

3)实际水样检测发现,该地区供水系统中10种藻毒素含量均低于方法检出限,没有超标现象发生


参考文献

[1] Nonga H E, et al. Possible involvement of microystins in the unexplained mass mortalities of lesser Flamingo(Phoeniconaias minorGeoffroy) at lake Manyara inTanzania[J]. Hydrobiologia, 2011, 678(1): 167-178.

[2] 谢平. 微囊藻毒素对人类健康影响相关研究的回顾[J]. 湖泊科学, 2009,21(5): 603-613.

[3] 江敏,许慧. 节球藻毒素研究进展[J]. 生态学报, 2014,34(16): 4473-4479.

[4] BURCH M D, et al. Effective doses, guidelines & regulations[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology, 2008, 619: 831-853.

[5] GB/T 20466-2006 水中微囊藻毒素的测定[S].

[6] GB/T 57508-2006 生活饮用水标准检验方法 有机物指标[S].

[7] 朱文涛,邵国建,张鹏,等. 全自动固相萃取-超高效液相色谱/串联质谱法测定水产品中9中微囊藻毒素[J]. 中国卫生检验杂志, 2019,29(2): 150-154.

[8] 沈斐,许燕娟, ,等. 超高效液相色谱-串联质谱法快速测定地表水中9中藻毒素[J]. 理化检验-化学分册, 2018,24(11): 1287-1291.

[9] 吴洁珊,倪清泉, 任永霞,等. 高效液相色谱-四级杆-高分辨飞行质谱直接进样测定饮用水中8种微囊藻毒素[J]. 食品安全质量检测学报, 2020,11(2): 544-549.


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