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应用宏基因组学技术广谱表征水环境中
抗生素耐药基因赋存状态及其宿主定位研究
更新时间:2021-03-05 来源: IWA国际水协会 作者:李炳

近年来,抗生素耐药细菌(ARB)和抗生素耐药基因(ARGs)的传播及其对公众健康的威胁已经引起了全世界的广泛关注。需要指出的是:抗生素耐药性不仅是临床医学问题,也是新兴的全球性环境污染问题。2017年联合国环境署发布的《2017前沿报告:全球环境的新兴问题》提出当前全球六大新兴环境问题中,“抗菌剂耐药性:环境调查”位列首位。目前普遍认为ARB/ARGs的环境传播介质主要为水、土壤和空气,水环境因具有较大的流动性和较高的生物量成为耐药基因重要的储存库。过去十余年的研究中,实时定量PCR(qPCR)作为一种主流方法用于环境中ARGs丰度和多样性的调查。然而,其通量低、效率低,可利用的ARGs引物数量少,且无法定位环境样品中抗生素耐药基因宿主(即ARB)。

随着高通量DNA测序技术的快速发展,宏基因组学可以实现对复杂环境样品中ARGs的全面分析。该方法不仅可以克服qPCR引物设计的局限性,基于相似性搜索的基因注释还能给出比qPCR方法更全面的ARGs总体信息,而且可以将该时刻该样品的全部序列存档以备将来对新的耐药基因的回溯翻查。此外,联合应用生物信息学网络分析(network analysis)、组装(assembly)与分箱(binning)的技术手段,可以实现基于非培养分离的方法来预测、鉴定耐药基因宿主,这是qPCR方法所无法比拟的优势。清华大学深圳国际研究生院李炳课题组瞄准国家生态环境保护战略需求与国际热点前沿,聚焦细菌耐药性这一危害公众健康和生态安全的全球性问题,应用宏基因组学检测方法,对水环境中抗生素耐药基因的赋存状态与宿主定位进行了深入研究,取得了一系列创新性成果。

水环境中抗生素耐药基因的赋存状态

率先应用宏基因组学技术对10类典型环境样品开展了耐药基因的广谱解析,揭示了底泥/土壤/地表水/饮用水–城市污水处理厂系统–畜禽粪便及养殖场废水处理系统这一全链条环境体系中耐药基因丰度分布规律以及耐药基因的源汇特征,证实了人类生产活动和抗生素使用是影响耐药基因在环境中分布和扩散的主要因子,显著提升了研究人员对于环境中耐药基因分布和赋存规律的认知水平,有效克服了传统分子生物学方法(PCR、qPCR、基因芯片)导致的认知局限和片面性(图1)。甄别出环境样品中存在的指示性抗生素耐药基因(ARGs indicator)并成功构建了其与相关联耐药基因的丰度量化关系,为简化预测样品中耐药基因的丰度提供了新的技术手段。首次提出并证实了城市污水厂进水中耐药基因丰度与多样性特征可以准确反映出城市污水处理厂集水区域范围内居民肠道中耐药基因赋存状态的整体均值(图2),为快速全面定量化表征大规模人群肠道中的耐药基因提供了新的有效途径。

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1. 典型环境样品中耐药基因的赋存状态:(a)50个环境样品中抗生素耐药基因的丰度分布(单位:ARGs拷贝数/16S-rRNA基因拷贝数);(b)不同类型环境样品间抗生素耐药基因总丰度比较。本图从左至右样品类型依次包括:底泥、土壤、河水、饮用水、污水厂活性污泥与生物膜、污水厂厌氧污泥、污水厂出水、人体粪便、污水厂进水、畜禽养殖场动物粪便及污水。

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2. 非度量多维尺度分析显示城市污水厂进水(图中样品编号:37、38)与人体粪便(图中样品编号:35、36)中的耐药基因丰度与多样性特征具有高度相似性。

与香港大学张彤老师课题组以及中科院城市环境研究所朱永官老师课题组开展合作研究,分别以城市污水处理厂进水、城市垃圾填埋场渗滤液和饮用水作为典型水环境介质代表,通过开展国内外(包括美国、新加坡、南非部分城市)大空间尺度系统采样及耐药基因丰度与多样性的广谱解析研究,成功建立了上述三类典型复杂环境介质中抗生素耐药组目录清单。发现全国空间尺度范围内城市生活污水中抗生素耐药基因总量分布规律符合“胡焕庸线”,揭示了人类活动和抗生素使用是影响抗生素耐药基因空间分布的关键因子,发现了普遍分布的核心耐药组结构与人体肠道微生物菌群之间呈显著正相关关系;阐明了填埋年限对渗滤液中耐药基因丰度与组成施加的显著影响;发现了饮用水中杆菌肽类、氨基糖苷类、磺胺类和β-内酰胺类耐药基因占据主导地位,证实了抗生素污染和饮用水中耐药基因的产生与传播有密切关联。该研究为此类高风险污染物在大尺度典型环境中的分布特征和传播扩散机制研究提供了详实的基础数据,并可为日后制订不同水环境介质中的抗生素耐药基准提供重要的科学依据。首次揭示了磺胺二甲基嘧啶、红霉素、林可霉素、卡那霉素、四环素及甲氧苄啶抗生素单一选择压力下对耐药基因的协同富集效应(图3),发现了抗生素制药厂废水中高浓度抗生素选择压力在显著增加耐药基因丰度的同时,可明显降低耐药基因的多样性。

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3. 单一抗生素选择压力对耐药基因的协同富集效应:(a)短序列比对结果显示磺胺二甲基嘧啶(SMZ)选择压力可显著富集磺胺类、氯霉素类及四环素类耐药基因;(b)短序列比对结果显示氯霉素(CHL)选择压力可显著富集氯霉素类、磺胺类、氨基糖苷类及四环素类耐药基因;(c)序列组装结果显示SMZ选择压力下磺胺类、氯霉素类及四环素类耐药基因共存;(d)序列组装结果显示CHL选择压力下氯霉素类、磺胺类、氨基糖苷类及四环素类耐药基因共存

水环境中抗生素耐药基因宿主定位

基于抗生素原位压力选择培养与二代高通量测序技术联用,以活性污泥中四环素耐药基因宿主定位的高通量筛查为切入点,率先建立了一套快速、灵敏、普适性高的四环素耐药细菌的定性与定量方法,首次发现了前人未曾报道过的6个四环素耐药菌属(图4a)。通过微生物群落的物种组成与抗生素耐药基因组成之间的共现网络模型分析,首次成功实现了10类典型环境样品中耐药基因宿主物种的高通量预测筛查,揭示出环境样品中耐药基因宿主的多样性与潜在致病性(图4b)。创新性地应用宏基因组学组装技术和分箱技术识别出处理抗生素生产废水的活性污泥中抗生素耐药基因宿主,并发现其多样性极高,涵盖9个门,多个抗生素耐药基因宿主具有多重耐药性特征,耐药基因亦表现出明显的宿主特异性模式(图4c)。上述方法的成功建立与应用,克服了传统方法由于细菌可培养性差而导致的耐药基因宿主鉴别率低等缺点,有效扩展了研究人员对于耐药基因宿主组成和多样性的认知水平。

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4. 抗生素耐药基因宿主定位:(a)抗生素原位压力选择培养与二代高通量测序技术联用鉴定四环素耐药基因宿主;(b)应用网络分析预测多类抗生素耐药基因宿主;(c)利用多维覆盖度差异分箱法复原MAGs鉴定多类抗生素耐药基因宿主。

总结及展望

宏基因组学具有其它方法无法比拟的广谱性,对于全面深入认识水环境中抗生素耐药基因的赋存规律与传播机制、鉴定耐药基因宿主至关重要。在未来的工作中,应博采多项技术(如高通量PCR、数字化PCR以及纳米孔测序等)之长,在检测灵敏性、实时快速检测、耐药基因风险分级等方向开展进一步的研究,从而为环境中耐药基因的有效管控提供理论依据与技术支撑。

相关文献:

张彤, 李炳. 水环境中抗生素耐药性的科学研究前沿、环境健康风险评估和控制阻断策略. 科学通报, 2020, 65

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